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Determinar o sorotipo de Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é importante para o seu controle, já que os diferentes sorotipos têm diferente potencial de virulência (dependendo da zona geográfica), e esta informação pode ser utilizada na escolha da vacina mais apropriada (Gottschalk, 2015). Com base na sua cápsula, há 18 sorotipos conhecidos de App (Bossé et al., 2018a), sendo 1, 5, 9 e 11 os mais virulentos. Com base nas necessidades de NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo), diferenciam-se os isolados do biotipo 1, biotipo 2, ou NAD-independentes.
Classicamente, para determinar o sorotipo são utilizadas análises sorológicas que incluem a aglutinação, a co-aglutinação, a imunodifusão, a hemaglutinação indireta e a precipitação no anel. Contudo, são necessários anti-soros específicos com títulos altos e as reações cruzadas entre sorotipos (ex. 3/6/8 e 1/9/11) são um problema. Encontramos que a maioria dos isolados do Reino Unido e da Irlanda definidos sorologicamente como sorotipo 3 pertenciam ao serotipo 8 (O'Neill et al., 2010). Devido a estes problemas, desenvolvemos análises moleculares usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) para ampliar sequências de DNA específicas de cada sorotipo que se encontram nos genes de biossintese da cápsula (Bossé et al., 2014). O uso destas sequências específicas de cada sorotipo permitiu desenvolver um teste específico para o sorotipo 16 (Bossé et al., 2017) e conduziu à recente descoberta dos sorotipos 17 e 18 (Bossé et al., 2018a). Com a descoberta dos sorotipos 16-18 decidimos produzir um teste de PCR que pudesse definir todos os sorotipos de App conhecidos. Contudo, os sorotipos 9 e 11 não podem ser diferenciados por PCR, já que os seus loci capsulares são praticamente idênticos (Bossé et al., 2018b) e tampouco podem ser determinados através de testes serológicos (Gottschalk, 2015). O teste de PCR tinha que confirmar o isolado como App e determinar o sorotipo específico. Para confirmar App, utilizamos primers que ampliavam uma região de 418 bp do gene apxIV, específico de App (Schaller et al., 1999). Contudo, devido ao grande número de sorotipos (n=18), tivemos que formular duas cadeias de multiplex PCR (mPCR), capazes, cada uma das quais, de detectar muitos sorotipos. O mPCR1 detecta os serotipos 1-12 e 15 (figura 1A) e o mPCR2 os sorotipos 13-14 e 16-18 (figura 1B). Os isolados que ampliam apenas uma banda apxIV no mPCR1 são analisados depois com o mPCR2.
O mPCR2 também confirma o biotipo mediante primers desenhados para ampliar um fragmento de 1339 bp do gene nadV (que confere a independência ao NAD). O conjunto de nucleotídeos nadV de 1339 bp só se detecta nas estirpes de referência do biotipo 2 (sorotipos 13-14). Devemos assinalar que outros sorotipos (p.e. 2, 4, 7 e 17) foram descritos como pertencentes ao biotipo 2 e alguns sorotipos de isolados norte-americanos do sorotipo 13 como pertencentes ao biotipo 1 (Gottschalk, 2015).
O modelo de DNA para as PCRs pode ser DNA purificado (quer seja de bactérias cultivadas ou de amostras de tecidos) obtido usando kits comerciais, lisados de células bacterianas inteiras fervidas ou colónias de uma cultura em placa. O DNA purificado fornece melhores resultados, enquanto que as PCRs de colônias podem dar resultados parciais/falsos negativos se as colônias são muito pegajosas e difíceis de lisar, como mostram os três isolados clínicos do sorotipo 2 que não só ampliaram a banda específica do sorotipo de PCR de colônia, mas que ampliaram tanto esta como a banda específica de apxIV ao usar DNA purificado (figura 2). Em raras ocasiões, os isolados não conseguirão ampliar apxIV, inclusive utilizando DNA purificado (Bossé et al., 2014). Quando isto acontece, podem utilizar-se primers alternativos de apxIV (oAPXIV-TSP1/2) para confirmar App (Tegetmeyer et al., 2008). mPCR1 e mPCR2 podem ser usados para identificar novos sorotipos, como fizemos com os 17 e 18 (Bossé et al., 2018a). Os isolados de App que produzem uma banda de apxIV mas não conjuntos de nucleotídeos específicos de sorotipo podem, potencialmente, ser um sorotipo novo, ainda que a ausência de uma banda específica de sorotipo possa ser devida a uma falta de concordância do primer em isolados divergentes ou dever-se à presença de um elemento de inserção que altera o locus da cápsula. O sequenciamento do genoma completo do isolado confirmará qual destas opções é a correta.
Em resumo, a monitorização de sorotipos de App numa granja ou país é importante para controlar a doença. Os nossos PCRs de sorotipagem (mPCR1 e mPCR2) são ferramentas úteis para identificar sorotipos virulentos, as vacinas corretas a serem utilizadas (comerciais ou autógenas) e para evitar que suínos com estirpes de App potencialmente virulentas sejam introduzidos em granjas não expostas. Além disso, esse método tem o potencial de identificar novos sorotipos de App e melhorar os diagnósticos.
Agradecimentos
A investigação sobre APP no laboratório dos autores tem o apoio do Conselho de Investigação de Biotecnologia e Ciências Biológicas do Reino Unido.
