Método LAMP: Uma alternativa simples, rápida e acessível ao PCR?

Testes baseados na detecção de ácidos nucleicos tornaram-se o teste de escolha para detectar a presença de patógenos em amostras de diagnóstico. A reação em cadeia da polimerase ou PCR é um procedimento de análise de ácidos nucleicos amplamente utilizado em laboratórios de diagnóstico e pesquisa. PCR é um procedimento que amplifica um minúsculo fragmento de DNA até o ponto em que é detectável como uma banda em uma tira de gel ou como um sinal fluorescente detectável por um equipamento e pode ser realizado em poucas horas. Para realizar um bom teste de PCR é necessário um investimento significativo em equipamentos, como termocicladores, laboratório especializado e pessoal treinado e experiente.

O que é o método LAMP?

LAMP (por sua sigla em inglês Loop-mediated isothermal amplification) é um método simples, rápido, sensível e preciso de detecção e amplificação de DNA/RNA que não requer equipamentos sofisticados e é relativamente barato. A reação é realizada em um tubo de microcentrífuga. O equipamento necessário para o método LAMP é simples: uma pipeta, ponteiras descartáveis ​​e um banho seco digital. Um banho-maria ou uma incubadora comum, ou mesmo uma garrafa térmica com água quente, podem ser suficientes como fonte de calor, mas para facilitar a higiene do laboratório, um termobloco digital é altamente recomendado (Figura 1).

Em uma aplicação LAMP típica, a mistura do tubo de ensaio conterá:

• Seis pedaços de DNA chamados primers ou primers que correspondem à sequência de DNA a ser detectada.
• Enzima polimerase específica (por exemplo, BST DNA polimerase).
• Buffers.
• Reagentes de suporte.
• Um corante indicador (indicador de pH ou coloração direta de DNA).
• Transcriptase reversa para vírus de RNA.
• A amostra a analisar.

Esta mistura é incubada a 60-65°C durante 30 minutos. Se houver DNA na amostra que corresponda aos primers, uma série de loops de DNA será formada. As alças tornam-se mais complexas e numerosas à medida que a reação de amplificação progride (Figura 2).

A amplificação da polimerase como um subproduto produz pirofosfato de magnésio que causa turbidez (nebulosidade) no tubo. Os corantes repórter que se ligam diretamente ao DNA fornecem um sinal fluorescente no espectro visível ou UV. Um sistema LAMP usando um indicador de pH vermelho de fenol muda de vermelho rosado para amarelo.

A Figura 3 mostra o resultado de um ensaio LAMP para peste suína africana (PSA) - O tubo A continha extrato do baço de uma matriz infectada por PSA. O alto teor de DNA viral gera uma cor amarela opaca. O tubo B era uma amostra de fluido oral da mesma matriz, com a carga viral mais baixa. A turbidez nos tubos A e B é evidente ao observar a linha de base. Os tubos C a F são tubos suspeitos e negativos.

Existem algumas variações da reação LAMP dependendo da tecnologia disponível. O teste pode ser aplicado em microplacas de 96 poços seladas com corantes colorimétricos ou fluorescentes ou medições de turbidez para um resultado quantitativo automatizado. Fotocélulas filtradas no bloco térmico e um LED adequado também podem automatizar a leitura fluorescente semiquantitativa em tempo real de tubos de microcentrífuga. A espectrofotometria com a câmera do celular pode tirar dúvidas sobre os tubos suspeitos naqueles casos em que o olho humano não consegue resolver o dilema.

A reação LAMP pode ser realizada no campo, in situ, para resultados convenientes "Point-of-Care" com espera mínima. Nosso laboratório construiu e verificou ensaios LAMP baratos (do zero e de kits) para peste suína clássica (PSC), circovírus suíno 2 (PCV2) e peste suína africana (como acima). Queríamos validar a ideia (para PSC) de que um lote de reprodutoras poderia ser testado economicamente antes da introdução no plantel reprodutivo usando o método LAMP.

As vantagens do método LAMP são a rapidez dos resultados, o mínimo de treinamento necessário, o baixo investimento em equipamentos, o espaço reduzido que ocupa no laboratório e o baixo custo total por amostra. Embora os custos possam variar, o custo do método LAMP é aproximadamente metade do custo da PCR e é ainda mais reduzido para matrizes simples em que a extração prévia de ácido nucleico não é necessária. Os laboratórios que desejam investir no desenvolvimento do método LAMP do zero com reagentes relativamente baratos e conjuntos de primers autocriados podem evitar o custo mais alto de um kit pronto para uso, mas devem arcar com os custos associados ao desenvolvimento, verificação e certificação.

A sensibilidade e especificidade do método LAMP é comparável à do PCR e pode dar resultados em 30 minutos. Algumas administrações aprovaram kits de teste LAMP comerciais para PSA e Covid-19.

As desvantagens do método LAMP incluem a falta de conhecimento por parte de alguns acadêmicos e pesquisadores e algum ceticismo sobre o método. O LAMP requer 6 (até 8) primers para cada gene a ser detectado e a geração de primers é mais difícil que a PCR convencional, mas existem ferramentas online. Para vírus de RNA altamente mutáveis, como PRRS, vários conjuntos de primers podem ser necessários na mistura, mas isso não impede seu uso. O método LAMP gera muito DNA e os tubos positivos geralmente não devem ser abertos após o teste para evitar a contaminação do laboratório. Amplicons LAMP não são prontamente passíveis de sequenciamento útil e o laboratório pode ter que recorrer a PCR convencional ou outros métodos para amostras positivas para LAMP quando o sequenciamento do vírus é necessário.

É fácil imaginar a aplicação do método LAMP em estabelecimentos pecuários, frigoríficos, bem como em ambientes mais rudimentares e remotos onde não é possível deslocar equipamentos sensíveis e dispendiosos. Quando instalações sofisticadas ou mesmo eletricidade não estão disponíveis e respostas binárias sim/não são obrigatórias para a tomada de decisões em tempo real e no local, o LAMP pode fornecer um caminho a seguir. Pelo baixo custo e não necessidade de equipamentos, poderia ter dificultado em alguma medida a proliferação do LAMP, pois algumas empresas e laboratórios universitários podem preferir instalações mais caras, dando maior importância ao retorno marginal do investimento do que ao custo real do equipamento, serviços de análises veterinárias mediante pagamento.

À medida que o mundo avança no controle e erradicação das principais doenças endêmicas transfronteiriças, como a peste suína africana (PSA), a síndrome respiratória suína (PRRS) e a peste suína clássica (PSC), a disponibilidade de um teste rápido, conveniente e acessível tem grande potencial para uso.

"Talvez ser prático demais seja uma loucura” - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Dom Quixote.