Guia prático para amostragem de fluido oral

As recentes pandemias (COVID-19 em humanos e peste suína africana em suínos) confirmaram para nós a importância das informações sobre a população para compreender e orientar efetivamente nossos esforços de saúde. A coleta de tais informações populacionais em suínos sempre foi problemática porque os sinais clínicos são altamente variáveis ​​e a amostragem individual é cara; entretanto, o uso de fluidos orais nos oferece uma alternativa fácil, eficiente e econômica para a vigilância epidemiológica.

Os fluidos orais são obtidos de um suíno ou de um grupo de suínos simplesmente pendurando uma corda de algodão na baia para que eles possam morder/mastigar e, em seguida, recuperar o fluido oral da corda molhada. Mais de 27 patógenos, incluindo a peste suína africana (PSA), peste suína clássica (PSC), febre aftosa, circovírus suíno (PCV), síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS), produzem níveis detectáveis ​​de ácidos nucleicos e/ou anticorpos específicos em fluidos orais. Hoje, esse tipo de amostra é comumente usado nos Estados Unidos para monitorar populações de suínos; Como exemplo, o Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Iowa State University processou cerca de 1,4 milhão de amostras de fluido oral entre 2010 e 2019.

Começando pelo começo:

1. Qual é o meu objetivo de sanidade a longo prazo? Como a vigilância me ajudará a atingir esse objetivo?
2. Entenda o processo: há muitos vídeos online que descrevem como e por que avaliar fluidos orais.

Amostragem de fluido oral:

1. Organize os materiais: tenha cordas, cortadores, sacos, tubos, etc., para cada galpão. Mantenha a biossegurança e evite transportar materiais de um galpão para outro.
2. Colete amostras no início da manhã: os suínos são mais ativos logo de manhã; Pegue as amostras antes de alimentá-los.
3. Use a “psicologia” suína: na primeira vez, permita que eles interajam com a corda suspensa por tempo suficiente para explorar e aprender o processo (cerca de 45 minutos). Se os suínos forem indiferentes, jogue no chão um metro de corda com nós nas pontas por cerca de 30 minutos. Assim que começarem a brincar, arraste lentamente a corda guiando os animais até o local escolhido e pendure uma corda nova para eles mastigarem. O uso de aromatizantes na corda ofereceu poucos benefícios na prática.
4. Quais animais testar? Os leitões antes do desmame são amostrados através da coleta de fluidos orais familiares (porcas e leitões). Os fluidos orais individuais ou em cercado podem ser coletados de suínos ≥ 21 dias de idade, incluindo porcas alojadas em grupo. Os fluidos orais podem ser coletados de varrões e porcas alojados individualmente, mas requer treinamento (ver # 3) e geralmente não é prático em grandes sistemas comerciais.
5. Siga uma rotina: pendure a corda no mesmo local na mesma hora do dia para estabelecer uma rotina. Os suínos aprenderão rapidamente o processo e saberão exatamente o que fazer nas amostragens subsequentes. Uma vez que um padrão é estabelecido, o tempo de coleta pode ser reduzido para 20 minutos. Não deixe a corda na baia por um longo período de tempo (horas) porque (a) a amostra será perdida com o tempo conforme a corda seca; (b) os suínos são fortes e destruirão a corda se houver tempo suficiente; (c) os suínos ficam entediados com a corda e simplesmente a ignoram.
6. Evite contaminação excessiva da amostra: Posicione a corda de forma que fique na altura dos ombros dos suínos, evitando que toque o solo. A matéria orgânica não afeta diretamente os testes de diagnóstico (RT-PCR ou ELISA), mas quanto menos matéria orgânica a amostra tiver, mais fácil será o processamento em laboratório.
7. Use saco e tubo limpos para cada amostra: Coloque a parte úmida da corda em um saco plástico, escorra e colete o líquido no tubo limpo que será enviado ao laboratório (previamente etiquetado). Remova as cordas das baias após cada amostragem para manter a novidade (os suínos também ficam entediados!)
8. Preserve a amostra: resfrie a amostra (4 °C) colocando-a no gelo ou na geladeira imediatamente após a coleta. Cálculos baseados em dados de Prickett et al., (2010) estimam uma meia-vida para RNA de PRRSV em fluidos orais de aproximadamente 13 horas a 30 °C, 42 horas a 20 °C e 14 dias a <10 °C. Os anticorpos contra PRRSV não foram detectados após 72 horas a 30 °C.

Fluidos orais para programas de vigilância:

1. Quantas amostras devo coletar e com qual frequência? Todos nós temos que seguir um orçamento. Ainda assim, algumas amostras, de 2 a 4 cordas por galpão (ou baia), em intervalos determinados (2-4 semanas), juntamente com os índices produtivos, nos fornecerão um relato eloquente do status sanitário da granja (gráfico 1).
2. Prepare um plano para avaliar constantemente as informações: Uma boa alternativa são os diagramas de controle de processo ou SPC.
3. Use "amostragem espacial fixa" para maximizar a detecção dentro do galpão: uma explicação prática desta metodologia pode ser encontrada online:
   1. Amostragem de fluidos orais (em inglês).
   2. Amostragem de fluidos orais (em espanhol).
4. Espere o inesperado: Tenha um plano para verificar ou descartar resultados de diagnóstico inesperados. Por exemplo: testar novamente as mesmas amostras em duplicata, reamostrar os suínos, analisar usando outro método, etc.
5. Lembre-se da história natural da doença para estabelecer um plano: Os testes de ácido nucléico detectarão a presença precoce do vírus, enquanto os testes de anticorpos detectarão a resposta imunológica prolongada resultante. As duas tecnologias funcionam melhor juntas para monitorar, por exemplo, a liberação de animais em quarentena.

Outras considerações:

1. Zebras e cavalos… coisas semelhantes não iguais: As amostras que podem parecer semelhantes a fluidos orais (por exemplo: esfregaços bucais ou nasais) podem não fornecer a mesma taxa de detecção. Exemplos de influenza A, febre aftosa, Senecavírus A e PRRSV são mostrados na tabela 1.
2. Não misture (acumule) fluidos orais e não mova as cordas de uma baia para outra: em vez de melhorar a taxa de detecção, esses processos podem criar falsos negativos.
3. Evite congelar e descongelar as amostras ou mudanças bruscas de temperatura: Os anticorpos nos fluidos orais são bastante resistentes, mas os ácidos nucléicos não são tão resistentes. Divida a amostra em várias alíquotas se precisar de vários testes. Na granja, não armazene amostras em freezers com degelo automático, pois o ciclo de degelo pode danificar os ácidos nucléicos. No laboratório, descongele as amostras na geladeira (4 °C) e não em temperatura ambiente. Essas práticas têm mostrado melhor conservação de ácidos nucléicos (Weiser et al., 2018).

Tabela 1. Comparação da detecção de ácido nucleico em fluidos orais versus swabs bucais ou nasais

nd = sem dados.

^aTasa de positividad (promedio) estimada para fluidos orales recogidos en corrales versus hisopo bucal o nasal. Datos tomados de Hole et al., (2019); Pepin et al., (2015); Romagosa et al., (2012); Senthilkumaran et al., (2017)